化活一脂氧性成抗油陈皮究分研

陈皮是陈皮芸香科植物橘(Citrus reticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮，属于药食两用中药，抗油具有理气健脾、脂氧燥湿化痰的化活作用。其化学成分以黄酮类为主，性成此外还含有柠檬苦素类、分研生物碱类、陈皮挥发油类及微量元素等，抗油具有抗菌、脂氧抗病毒、化活抗突变、性成抗肿瘤、分研抗过敏等药理作用。陈皮目前文献报道多集中在其资源品质、抗油化学成分、脂氧含量分析及药理方面，在食品方面的应用主要是将其加工成各类形态、风味特征的食品，如果酱、糕点、饮料等。研究表明，陈皮具有抗氧化作用，如Jiang X R等发现陈皮干浸膏对肉鸡生长性能及免疫抗氧化能力具有影响；Liang S H等发现陈皮多糖对·OH有清除作用；王卫东等发现陈皮黄酮具有较强抗氧化活性。而对于陈皮单体化学成分作为食品抗氧化剂的应用研究很少。

油脂氧化易对油脂的风味、色泽产生不良影响，是影响油脂品质的一个重要因素，同时会对机体蛋白质造成破坏，危害人体健康，在油脂中添加抗氧化剂是延缓油脂氧化最为有效的方法。油脂抗氧化剂按其来源可分为人工合成抗氧化剂和天然抗氧化剂，许多植物成分具有抗氧化性能，从中开发广谱、高效、安全的天然抗氧化剂已成为当今食品添加剂研究领域中的热点之一。文献报道多为茶叶、香辛料、中草药提取物的抗氧化作用，活性成分主要为黄酮类、多酚类、皂甙类、鞣质类、维生素类、褪黑素类等，涉及单体化合物的研究较少，尚需在有效成分的抗氧化机理、协同作用、构效关系和分子设计等方面开展深入研究。基于不同的作用机理，抗氧化活性评价方法也多种多样，自由基清除能力是最常用的体外抗氧化活性测定模型，其中，卜二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法具有操作简单、方便、快速、准确等优点。而脂质过氧化是一个产生自由基和自由基参与链式反应的过程，目前多采用亚油酸体系、卵黄脂蛋白体系、食用油体系、小鼠肝脏匀浆体系和小鼠红细胞脂质过氧化体系等进行体外抗脂质过氧化理论研究。

本实验首先采用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇和蒸馏水四种不同极性的溶剂对陈皮粉进行回流提取，得到相应的提取物，研究它们在不同浓度下对DPPH自由基这种比较简单的抗氧化模型的清除作用，确定抗氧化效果较好的提取物，以缩小进一步活性筛选的范围；然后将该提取物进行柱层析初步分离得到不同极性的洗脱物，以抑制亚油酸过氧化作为活性筛选方法，得到效果较强的洗脱物；接着将该洗脱物进行制备薄层层析法分离，以亚油酸过氧化及卵黄脂质过氧化的抑制作用为进一步活性筛选方法，得到活性较好的单体成分；最后测定该单体化合物在不同浓度下对DPPH、亚油酸过氧化、卵黄脂质过氧化及食用油氧化的抑制作用并确定其结构。以期逐步筛选得到效果较好的天然抗氧化剂，为其应用于食品工业中提供理论参考。

一、材料与方法

1、材料与试剂

DHG-9240A电热鼓风干燥箱，上海恒科学仪器有限公司；DFY-XS00高效多功能粉碎机，温州顶历医疗器械有限公司；HJ一6A数显磁力搅拌电热套，北京中兴伟业仪器有限公司；RE一52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHZ—DⅢ循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；YP3001N电子天平、JA2003N电子天平，上海精密科学仪器有限公司； TDL-409台式离心机，上海安亭科学仪器厂WD一9403C紫外仪，北京市六一仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂；V-11OOD可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司l UV—vis 2550型紫外可见分光光度计，日本岛津一GL(上海)商贸有限公司；XT4A显微熔点测定仪(控温型)，北京科仪电光仪器厂；FTIR一840傅立叶变换红外光谱仪，日本岛津公司；Avance AV500MHz型超导核磁共振仪，德国Bruker公司；Waters UPLC—SQD单四极杆液质联用仪，美国Waters公司。

陈皮，肇庆市邦健大药房提供，肇庆学院生命科学学院实验室中心鉴定为芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮；食用级大豆油，山东鲁花集团有限公司；98％2，2一二苯基一1一苦味酰基自由基，德国Meker公司；羧甲基纤维素钠、GF254薄层层析用硅胶、100—200目柱层析用硅胶，青岛海洋化工有限公司；三氯乙酸、亚油酸、卵磷脂、维生素C、硫代巴比妥酸、硫酸铜，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石油醚、乙酸乙酯、氯仿、95％乙醇、无水乙醇、正丁醇，分析纯，广州化学试剂厂。

2、实验方法

（1）各样品的制备

①陈皮提取物的制备参考文献方法

提取：将陈皮干燥、粉碎、过100目筛后依次用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇和蒸馏水进行提取，各提取液减压蒸馏除去溶剂，烘箱50℃干燥，得到石油醚提取物(提取物1)、乙酸乙酯提取物(提取物2)、无水乙醇提取物(提取物3)和水提取物(提取物4)，观察颜色外观、称重并计算得率，得率(％)=各提取物质量／陈皮粉质量×100％。测定它们在无水乙醇或蒸馏水中的溶解度，冰箱保存备用。

②洗脱物的制备

将抗氧化活性初筛较显著的提取物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集不同梯度的洗脱液，减压浓缩回收溶剂，剩余物转移至小烧杯中，室温挥干溶剂后烘箱50℃干燥，得到洗脱物1～6，观察颜色外观、称重并计算得率，得率(％)=各洗脱物质量／相应提取物质量×100％。测定它们在无水乙醇中的溶解度。

③单体化合物的制备

抗氧化活性筛选较显著的洗脱物用无水乙醇溶解，采用制备薄层层析法分离。将硅胶GF₂₅₄与0.5％羧甲基纤维素钠水溶液(19∶3mL)混合均匀铺在大玻璃板上，室温晾干后105℃活化，点样，石油醚／乙酸乙酯展开，紫外反射仪上观察，将比较明显的斑点刮下，无水乙醇溶解后过滤，滤液放在通风橱中缓慢挥发，有固体析出，过滤收集固体，得到化合物1～6，50℃烘箱干燥。观察各化合物颜色外观、称重并计算得率，得率(％)=各化合物质量／相应洗脱物质量×100％，测定它们在无水乙醇中的溶解度。

（2）抗氧化涪陛筛选实验

④清除DPPH活性测定提取物1、2和3用无水乙醇溶解，提取物4用蒸馏水溶解，首先确定各提取物的饱和浓度，为了便于比较，将四种提取物统一配制成较小饱和浓度值的储备液，再用二倍稀释法稀释，选择合适的测试浓度范围，最终四个待测提取物溶液浓度取值分别为0．14、0.27、0.54、1.08和2.15mg／mL。以抗坏血酸(维生素C)为对照，清除DPPH活性测定方法：取1.0mL各待测溶液，加入3.0mL的4099／mL DPPH乙醇溶液混合，室温避光反应30min后于517nm下测定吸光值，计算其清除率，清除率(％)=(A₀一As)／A₀×100％，其中A₀为空白组吸光度，As为样品组吸光度值。

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